我們生活在一個由RNA制造和運行的世界，RNA是基因分子DNA的同等重要的兄弟姐妹。事實上，進化生物學家假設(shè)RNA甚至在DNA及其編碼的蛋白質(zhì)出現(xiàn)之前就存在并自我復制?？爝M到現(xiàn)代人類：科學表明，不到3%的人類基因組被轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)分子，而信使RNA(mRNA)分子又被翻譯成蛋白質(zhì)。相比之下，其中82%被轉(zhuǎn)錄成具有其他功能的RNA分子，其中許多仍然是神秘的。

要了解單個RNA分子的作用，需要在其組成原子和分子鍵的水平上破譯其3D結(jié)構(gòu)。研究人員經(jīng)常研究DNA和蛋白質(zhì)分子，方法是將它們變成規(guī)則堆積的晶體，可以用X射線束(X射線晶體學)或無線電波(核磁共振)檢查。然而，這些技術(shù)不能以幾乎相同的效率應(yīng)用于RNA分子，因為它們的分子組成和結(jié)構(gòu)靈活性阻止它們?nèi)菀仔纬删w。

現(xiàn)在，由WyssCore教員PengYin博士領(lǐng)導的一項研究合作。在哈佛大學Wyss仿生工程研究所和MaufuLiao博士。在哈佛醫(yī)學院(HMS)，報告了一種全新的RNA分子結(jié)構(gòu)研究方法。ROCK，顧名思義，使用RNA納米技術(shù)，可以將多個相同的RNA分子組裝成高度有序的結(jié)構(gòu)，從而顯著降低單個RNA分子的靈活性并使其分子量成倍增加。研究小組將具有不同大小和功能的著名模型RNA用作基準，表明他們的方法能夠使用稱為冷凍電子顯微鏡的技術(shù)對所含RNA亞基進行結(jié)構(gòu)分析(冷凍電鏡)。他們的進展發(fā)表在NatureMethods中。

“ROCK正在打破目前RNA結(jié)構(gòu)研究的限制，并能夠以近原子分辨率解??鎖現(xiàn)有方法難以或不可能訪問的RNA分子的3D結(jié)構(gòu)，”Yin說，他與Liao一起領(lǐng)導了這項研究.“我們預計這一進展將振興基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)的許多領(lǐng)域，包括新興的RNA治療領(lǐng)域。”Yin還是Wyss研究所分子機器人計劃的負責人，也是HMS系統(tǒng)生物學系的教授。

獲得對RNA的控制

威斯研究所的尹教授團隊開創(chuàng)了各種方法，使DNA和RNA分子能夠根據(jù)不同的原理和要求自組裝成大型結(jié)構(gòu)，包括DNA磚和DNA折紙。他們假設(shè)這種策略也可用于將天然存在的RNA分子組裝成高度有序的環(huán)狀復合物，通過將它們特異性連接在一起，它們的彎曲和移動自由度受到高度限制。許多RNA以復雜但可預測的方式折疊，小片段彼此堿基配對。結(jié)果通常是穩(wěn)定的“核心”和“莖環(huán)”向外圍凸出。

“在我們的方法中，我們安裝了‘接吻環(huán)’，將屬于相同RNA的兩個拷貝的不同外周莖環(huán)連接起來，從而形成一個整體穩(wěn)定的環(huán)，包含多個感興趣的RNA拷貝，”Di說劉博士，兩位第一作者之一，尹氏課題組博士后。“我們推測這些高階環(huán)可以通過cryo-EM進行高分辨率分析，該技術(shù)已首次成功應(yīng)用于RNA分子。”

描繪穩(wěn)定的RNA

在低溫EM中，許多單個粒子在低溫下被快速冷凍以防止任何進一步的運動，然后通過電子顯微鏡和計算算法的幫助進行可視化，這些算法比較粒子的2D表面投影的各個方面并重建其3D結(jié)構(gòu).Peng和Liu與Liao和他的前研究生FrançoisThélot博士合作，后者是該研究的另一位共同第一作者。Liao和他的團隊為快速發(fā)展的低溫電磁場以及特定蛋白質(zhì)形成的單個粒子的實驗和計算分析做出了重要貢獻。

“與傳統(tǒng)方法相比，Cryo-EM在查看包括蛋白質(zhì)、DNA和RNA在內(nèi)的生物分子的高分辨率細節(jié)方面具有很大優(yōu)勢，但大多數(shù)RNA的小尺寸和移動趨勢阻礙了RNA結(jié)構(gòu)的成功確定。我們組裝RNA多聚體的新方法通過增加RNA的大小并減少其運動，同時解決了這兩個問題，”同時也是HMS細胞生物學副教授的廖說。“我們的方法為通過冷凍電鏡快速測定許多RNA的結(jié)構(gòu)打開了大門。”RNA納米技術(shù)和cryo-EM方法的整合使該團隊將他們的方法命名為“通過安裝接吻環(huán)實現(xiàn)RNA寡聚化的cryo-EM”(ROCK)。

為了為ROCK提供原理驗證，該團隊專注于來自單細胞生物四膜蟲的大內(nèi)含子RNA和來自固氮細菌Azoarcus的小內(nèi)含子RNA，以及所謂的FMN核糖開關(guān).內(nèi)含子RNA是散布在新轉(zhuǎn)錄的RNA序列中的非編碼RNA序列，必須“剪接”出來才能生成成熟的RNA。FMN核糖開關(guān)存在于與維生素B2衍生的黃素代謝物生物合成有關(guān)的細菌RNA中。在結(jié)合其中一種黃素單核苷酸(FMN)后，它會轉(zhuǎn)換其3D構(gòu)象并抑制其母RNA的合成。

“將四膜蟲I組內(nèi)含子組裝成環(huán)狀結(jié)構(gòu)使樣品更加均勻，并能夠利用組裝結(jié)構(gòu)的對稱性使用計算工具。雖然我們的數(shù)據(jù)集規(guī)模相對適中，但ROCK的先天優(yōu)勢使我們能夠以前所未有的分辨率解決結(jié)構(gòu)問題，”Thélot說。“RNA的核心分辨率為2.85Å[1Ångström是100億(US)米，是結(jié)構(gòu)生物學家使用的首選度量標準]，揭示了核苷酸堿基和糖骨架的詳細特征。我不認為我們沒有ROCK就可以到達那里——或者至少在沒有更多資源的情況下不會。”

Cryo-EM還能夠捕獲處于不同狀態(tài)的分子，例如，如果它們改變其3D構(gòu)象作為其功能的一部分。將ROCK應(yīng)用于Azoarcus內(nèi)含子RNA和FMN核糖開關(guān)，該團隊設(shè)法識別了Azoarcus內(nèi)含子在其自剪接過程中轉(zhuǎn)變的不同構(gòu)象，并揭示了FMN核糖開關(guān)配體結(jié)合位點的相對構(gòu)象剛性.

“彭寅和他的合作者的這項研究優(yōu)雅地展示了RNA納米技術(shù)如何作為促進其他學科發(fā)展的加速器。能夠可視化和理解許多天然存在的RNA分子的結(jié)構(gòu)可能會對我們對許多生物學和病理學的理解產(chǎn)生巨大影響跨不同細胞類型、組織和生物體的過程，甚至可以實現(xiàn)新的藥物開發(fā)方法，”Wyss創(chuàng)始董事DonaldIngber醫(yī)學博士說。